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點擊 4826回答 0 2023-04-27 20:04

高效液相色譜如何選擇？

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高效液相色譜儀(HPLC)是應用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點不易揮發的、受熱不穩定的和分子量大的有機化合物的儀器設備。具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復性好、應用范圍廣等優點。該法已成為現代分析技術的重要手段之一，目前在化學、化工、醫藥、生化、環保、農業等科學領域獲得廣泛的應用。

和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統也由固定相和流動相組成，這里主要講一下固定相，也就是色譜柱填充物。

一、固定相：
高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。

剛性固體：以二氧化硅為基質，可承受7.0×108~1.0×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，可擴大應用范圍，泛用性極強。

硬膠：主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯而成。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類：

      1.表面多孔型固定相
      它的基體是實心玻璃球，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化硅、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小、柱效高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達到平衡，較適合做常規分析。由于多孔層厚度薄，大允許量受到限制。

     2.全多孔型固定相
     由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。這類固定相由于顆粒很細（5~10um），孔仍然較淺，傳質速率快，易實現高效、高速。特別適合復雜混合物分離及痕量分析。

二：色譜柱基質選擇：

1.硅膠基質：

1.1反相色譜柱：

反相色譜填料常是以硅膠為基礎，所使用的流動相極性較強，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強組合最先被沖出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。

1.2正相色譜：

正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)，以及其他具有極性官能團，如胺基團(NH2,APS)和氰基團(CN，CPS)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他團的極性較強，因此，分離的次序是依據樣品中的各組份的極性大小，即極性強弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動相極性相對比固定相低，如：正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene  Chloride)等。

1.3離子交換色譜柱：

主要是以磺化交聯強陰/陽離子鍵合硅膠色譜柱，常用規格：強陰離子色譜柱(SAX)，強陽離子交換色譜柱(SCX)

2.聚合物基質：

聚合物調料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優點是在PH值為1～14均可使用。相對與硅膠基質的C18填料，這類填料具有更強的疏水性；聚合物填料的缺點是相對硅膠基質填料，色譜柱柱效較低。小分子在這種基質中柱效低。對于大分子像蛋白質或合成的高聚物，聚合物基質的效能比得上陶瓷性基質。因此，聚合物基質廣泛用于分離大分子物質。

3.其他無機填料

其它HPLC的無機填料，由于其特殊的性質，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強，石墨化碳可用于分離某些幾何導構體，又由于HPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。

氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強，可制成穩定的色譜柱柱床，其優點是可在PH高達12的流動相中使用。

但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強，應用范圍受到一定的限制；新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用PH范圍1～14，溫度可達100℃，其重要用途與優勢尚在進行中。

一句話選擇：硅膠基質的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。

色譜柱尺寸的選擇：
應用目標 柱內徑（mm）
極高靈敏度，LC/MS,多肽和蛋白質 0.1,0.075
極高靈敏度，樣品有限，LC/MS,多肽和蛋白質 0.3，0.5
高靈敏度，樣品有限，LC/MS 1.0
節省溶液，特殊的低體積儀器 2.1
特殊檢測儀，如質譜儀 2.1
高靈敏度，樣品有限 2.1
節省溶液，標準的HPLC，LS/MS 3.0
標準分離 4.6
mg級制備性分離 9.4
0.1~1g制備性分離或半分離 21.2
~100g制備性分離 30,50
中試和生產 100~1000


三、流動相：
對流動相溶劑的要求是：
1.溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。
2.溶劑與檢測器匹配。
3.純度高：色譜純及以上。
4.化學穩定性好
5.低粘度：若使用高粘度溶劑，色譜系統壓力增高，不利于分離。
常用的低粘度溶劑：丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們容易在色譜柱或檢測器內形成氣泡，影響分離。

四、檢測器：
選用的檢測器應該清晰的區別流動相與被檢測物質。

五、進樣器
除了一些實驗室的樣品較少以外需要手動進樣以外，現在一般選擇自動進樣器。

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